人类自然杀伤细胞(Nature Killer Cell，NK)占所有循环淋巴细胞的15%。NK细胞发现于20世纪70年代，主要与杀死感染的微生物和恶性转化的同种异体和自体细胞有关。

　　NK细胞来源于CD34+共淋巴祖细胞。据估计，NK细胞的半衰期大约为7~10天，它占人类外周血淋巴细胞总数的10-15%，也存在于脾脏、肝脏、肺、骨髓和淋巴结中，它们通过与DC细胞的相互作用发挥关键的免疫调节功能。

　　NK细胞是第一组固有淋巴样细胞的典型成员，具有分泌 IFN-γ 的能力。

　　终末分化的 NK 细胞缺乏B淋巴细胞(CD19-)和 T 淋巴细胞(CD3-)的表型标记，CD56是NK细胞特征的标志。

　　人外周血NK细胞可分为CD56bright和CD56dim两大类。　　

　　1、NK细胞疗法概述

　　CAR-T细胞免疫治疗技术发展迅速，但在临床应用中仍存在一些不足，例如在实体瘤的治疗中显示出很低的疗效;不同的患者对CAR-T治疗的耐受力有着很大的差别，部分患者会产生不同程度的神经毒性和细胞因子风暴。

　　这也是CAR-T治疗致力于改善的一个方向。

　　自然杀伤细胞(Nature Killer )，成为一个充满潜力的候选疗法。

　　1975年，Kiessling等人给出了NK 细胞的基本定义。NK细胞来源非常广泛，比如外周血、脐带血、胚胎干细胞、人类诱导多能干细胞和NK细胞系。

　　细胞因子风暴(CRS)是由CAR-T细胞分泌的INF-γ、TGF-α、IL-1和IL-6因子等诱导的。然而，NK细胞分泌IL-3和GM-CSF，因此不太可能引起CRS。

　　由于肿瘤微环境中PD-1的表达，CAR-T细胞的功能受到抑制。NK细胞分泌的PD-1水平较低，免疫抑制作用较小，这使NK细胞成为抗实体瘤的理想候选细胞。

　　此外，NK细胞促进DC细胞迁移到肿瘤中，从而增强抗PD-1免疫治疗。

　　NK细胞对肿瘤细胞具有一定的杀伤效果，而且不受MHC识别的限制，是肿瘤免疫治疗的潜在治疗方式。

　　异体来源NK细胞几乎不会诱发移植物抗宿主病(GVHD)，不会导致CRS，可以作为完全“现货型”产品使用。

　　在临床前和临床试验中，CAR-NK细胞疗法当之无愧成为细胞疗法中的热门选手。

　　2、CAR-NK细胞概述

　　CAR(嵌合抗原受体)技术是基因工程与免疫疗法的完美融合，是当前肿瘤治疗领域最具前景的研究方向之一。　　

　　CAR-NK细胞，由识别肿瘤特异抗原的细胞外信号结构域、跨膜区和细胞内结构域组成，它们可以建立新的激活途径，以增强靶细胞的溶解。

　　CAR-NK细胞，不仅通过CAR特异性识别抗原表达肿瘤的能力，而且通过NK细胞受体自身来消除肿瘤。

　　NK细胞的活性取决于是刺激和抑制信号的平衡，而不是抗原特异性。这些信号激活衔接蛋白，释放穿孔素和颗粒酶，并控制细胞因子的产生。

　　NK细胞的另一种杀伤机制，涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。因此，CAR-NK细胞的靶向裂解基于CAR依赖和NK受体依赖机制，并且裂解也适用于抗原阴性膜的肿瘤。

　　3、CAR-NK细胞疗法的研究现状

　　NK细胞的临床前试验，证明了其在造血干细胞治疗后对AML的临床治疗能力。

　　然而，肿瘤逃避免疫监视，NK细胞的临床治愈率也不高，因此限制了它们的治疗前景。

　　CAR修饰被认为是NK细胞提高细胞毒性的一种策略。

最近，CAR修饰的NK细胞在肿瘤中的作用正在被广泛研究。　　

　　根据clinical.gov网站上的临床数据，已有200多项关于CAR-T细胞的研究。

　　然而，有9项涉及CAR-NK细胞。

　　4、临床应用障碍和应对策略

　　CAR-NK细胞疗法的改进

　　迄今为止，CAR-NK细胞疗法进行了广泛的临床前研究。

　　患者源性肿瘤异种移植(PDX)模型，是临床癌症的优秀模型，因为它直接将肿瘤从患者转移到NSG或NOG小鼠。

　　大多数CAR-NK细胞疗法在临床前试验中已在PDX模型中进行了疗效评估，包括针对血液瘤靶点(如CD19、CD20、CD138和CS-1)和实体瘤(如HER2、GD2、PSCA和EGFRvIII)。

　　与PDX相比，人源化小鼠更为精确。通过将干细胞回输到免疫缺陷小鼠体内以使其发育人类免疫系统，克服了PDX模型未能观察到CAR-NK/T对肿瘤微环境中宿主免疫细胞影响的失败。　　

　　临床应用障碍和应对策略

　　CAR-NK细胞疗法具有巨大的潜力，但需要解决一些基本问题，以扩大其临床应用。

　　首先，NK细胞体外培养扩增是第一道障碍。单个供体的NK细胞数量不足以进行治疗，这使得NK细胞的扩增和激活变得非常关键。通常需要两到三周来培养NK细胞。

　　供体细胞数量的可用性仍然是一个障碍。此外，必须完全清除T细胞，以防止GVHD。

　　因此，如何获得足够的NK细胞仍是一个挑战。

　　第二，选择合适CAR很关键。目前的CARs是为构建CAR-T细胞而设计的。

　　因此，对于NK细胞来说，是次优的选择。CAR结合表位的位置及其与CAR-NK细胞表面的距离影响其结合抗原和激活CAR-NK细胞的能力。

　　第三，选择合适的方法将CAR转化到NK细胞是CAR-NK细胞免疫治疗的关键。

　　到目前为止，病毒载体和非病毒载体都被用来转化CAR。

　　虽然逆转录病毒载体的转染效率很高，但它可能会引起插入突变、致癌和其他不良反应。而慢病毒载体尽管显示出较低的插入突变发生率，但其对外周血NK细胞的转染效率低至20%。

　　睡美人系统已成功应用于CAR-T。然而，它对CAR-NK结构的适用性尚不清楚。mRNA转染CAR-NK细胞也被认为是一种安全、实用的转染方法。

　　最后，NK细胞对冻融过程敏感。解冻后NK细胞的存活率和细胞毒性显著降低。

　　一些研究小组发现，加入IL-2可以部分恢复冷冻NK细胞的活性。为了使细胞冷冻保存成为可行的最佳策略，必须对冷冻NK细胞进行探索。

　　5、安全性和有效性提高的新策略

　　CAR-NK细胞疗法的安全性

将自杀基因整合到CARs和双特异性CARs中可以提高CAR-NK细胞治疗的安全性。　　

　　HSV-TK/GCV自杀系统在20世纪90年代首次用于干细胞治疗。凋亡途径，如Fas和caspase9已经被利用。

　　CAR掩蔽肽由阻断抗原结合位点的掩蔽肽和蛋白酶结合点组成。当蛋白酶裂解连接从TME中的掩蔽肽分离时，CAR-T细胞可以在肿瘤局部保持活性。

　　将HIF1的氧敏感域与CAR结构融合，设计了氧敏感CAR。此外，CAR-T被设计成当synNotch和CAR配体在肿瘤上共同表达时激活，这是一种在空间上识别并有效控制CAR-T细胞激活的策略。

　　此外，临床治疗正在进行，以评估抗CD19/CD22(NCT03448393)和抗CD19/CD20(NCT03271515)的双特异性CAR-T细胞治疗的疗效，以防止抗原丢失引起的复发。

CAR-NK细胞疗法的有效性　　

　　在设计CAR-NK细胞的过程中，沉默NK抑制受体使其对肿瘤有更强的抵抗力。

　　当IL-4和IL-7受体结构域与反向细胞因子受体(4/7 ICR)融合并添加到CAR构建物中时，一些研究组发现来源于肿瘤的IL-4抑制作用降低，促进了CAR-T细胞的增殖。

　　转染CAR/ICR的T细胞在体内对含IL-4的TME具有持续的抗肿瘤作用。考虑到CAR-NK细胞的特异性，ICR受体(IL-15，IL-21)是否适用于CAR-NK细胞，尚需进一步研究。

　　有趣的是，CAR-T/NK细胞维持着固有的代谢过程。以4-1BB作为共刺激分子的CAR-NK细胞依赖于氧化代谢，增强线粒体活性、NK细胞增殖和持久性，并增强抗PD-1活性。

　　因此，可以尝试通过调节CAR-T/NK细胞的代谢来提高疗效。

　　6、文末小结

　　NK 细胞具有独特的抗肿瘤效应，不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。

　　CAR-NK 细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。相信，CAR-NK细胞疗法可能会导致肿瘤免疫治疗的革命性进展。

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