货号：1001
规格：500mL&25mL
库存：充足

产品概述

       本产品适用于人间充质干细胞体外培养，尤其适用于脐带、胎盘和脂肪组织来源提取的间充质干细胞的培养，包括基础培养基和添加剂两部分。基础培养基中含有多种氨基酸、微量元素等，已添加Hepes和L-谷氨酰胺。添加剂中含有多种细胞因子和重组人白蛋白等成分。为保障活性，建议添加剂部分一次解冻后分装再冻存，不宜反复冻融。

技术指标

      （一）基础培养基

       1．物理性状：红色，澄清透明。pH 7.1-7.4

       2．细菌培养：阴性

       3．真菌培养：阴性

       4．热    源：≤0.25U/ml

       5．细胞生长：良好

      （二）添加剂

       1．物理性状：黄色透明。pH 6.0-6.5

       2．细菌培养：阴性

       3．真菌培养：阴性

       4．热    源：≤0.25U/ml

       5．细胞生长：良好

       6.  HIV抗体I+II型/P24抗原检测：阴性

       7.  HBV核酸检测：阴性

       8.  HCV核酸检测：阴性

       9.  梅毒螺旋体特异性抗体检测：阴性

     10.  巨细胞病毒核酸扩增定量检测：阴性

     11.  EB病毒核酸扩增定量检测：阴性

     12.  沙眼衣原体核酸扩增检测：阴性

     13.  肺炎支原体培养：阴性

     14.  细小病毒B19-IgM+IgG检测：阴性

     15. 单纯疱疹病毒II型核酸扩增检测阴性

所有的培养基项目，均按照上海市生物医学行业协会发布的《人体细胞及组织培养用无血清培养基标准》执行。在微生物检测方面，在该标准的基础上，除开展热源、细菌和真菌的检测项目外，增加了乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋、单纯疱疹、巨细胞病毒、EB病毒和细小病毒B19等病毒的检测，以及肺炎支原体培养、沙眼衣原体核酸检测和梅毒特异性抗体的检测。所有以上项目，均由第三方检验中心完成，从而最大程度保障了培养基使用的安全性。

产品规格

产品优势：

1.     无任何动物成分，从而避免异种蛋白引起的免疫反应。

2.     适用于脐带、胎盘、脂肪、骨髓、牙髓等多种组织来源，人间充质干细胞的培养。

3.     培养基质检标准，严格按照上海细胞治疗协会规定的《人临床试验用培养基的标准》执行。

4.     经过专有技术处理，以杀灭可能存在的病毒等微生物。上海细胞治疗协会规定的微生物检测项目，包括HIV，梅毒螺旋体、乙肝病毒、丙肝病毒、细菌、真菌及热源共七项，而该培养基在此要求的基础上，增加了人类常见感染的巨细胞病毒、EB病毒、沙眼衣原体、肺炎支原体、解脲支原体、微小病毒等检测项目，检测方法不但使用抗体检测，同时还开展了核酸检测，结果均为阴性。

5.     微生物质检项目由临床检验资质的第三方实验室完成。

6.     某些生物技术企业利用该培养基申报间充质干细胞药物，并获得国家FDA批准，开展脐带间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎的II期临床试验。

7.     已完成I类医疗器械备案，备案号为闽泉械备20210016。

应用举例

       采用酶消化法从健康脐带组织华通氏胶中分离MSC，全程采用本培养基及附带的添加剂培养，无血清或其他成分添加。记录细胞形态变化（图1-4）并检测表面标志（图5）。

图1 消化法原代培养的人脐带组织MSC(Day3)(Bar:100 μm)

原代细胞培养3天后，PBS洗涤去除未贴壁细胞，可见大量贴壁细胞，均匀分布，形状近似梭形。

图2 P1代人脐带组织MSC(Bar:100 μm)

       原代细胞80%融合后胰酶消化，按1：3传代，传代后第三天拍照，可见细胞呈细梭形，胞体折光性好，分裂相多，背景干净。

图3 P5代人脐带组织MSC(Bar:100 μm)

       细胞传至第5代，细胞形态仍为长梭形，未发生肥大、颗粒化等现象，细胞增殖活跃，仍处于良好生长状态。

图4 P9代人脐带组织MSC(Bar:100 μm)

      传代至第9代时，细胞仍保持较好的增殖状态。细胞凸起略变长，但仍保持梭形，没有出现肥大、颗粒化现象。

CONTROL

CD31-FITC-CD44-PE

CD45-FITC/CD73-PE      

CD29-PE

图5 P5代人脐带组织MSC表型流式分析。流式结果显示，P5代细胞99%以上具有MSC典型表面标志特征（CD45-,CD31-,CD73+,CD44+）

产品说明书

产品概述

       本产品适用于人间充质干细胞体外培养，尤其适用于脐带、胎盘和脂肪组织来源提取的间充质干细胞的培养，包括基础培养基和添加剂两部分。基础培养基中含有多种氨基酸、微量元素等，已添加Hepes和L-谷氨酰胺。添加剂中含有多种细胞因子和重组人白蛋白等成分。为保障活性，建议添加剂部分一次解冻后分装再冻存，不宜反复冻融。

技术指标

      （一）基础培养基

      1．物理性状：红色，澄清透明。pH 7.1-7.4

      2．细菌培养：阴性

      3．真菌培养：阴性

      4．热    源：≤0.25 U/ml

      5．细胞生长：良好

     （二）添加剂

      1．物理性状：黄色透明。pH 6.0-7.0

      2．热    源：≤0. 25 U/ml

      3．细胞生长：良好

微生物检测项目：

产品规格

操作方法

一、完全培养基的配制

    将添加剂（25 ml）室温或2-8 °C过夜融化，加入500 ml基础培养基中，即为完全培养基。为维持添加剂中细胞生长因子的活性，请将配制的完全培养基置于4 °C避光保存，储存时间不宜长于4周，2周内用完最佳。

二、人骨髓间充质干细胞培养

1、 将骨髓样品制备成单细胞悬液，推荐使用密度梯度离心法获得单个核细胞进行以下实验。

★ 注意：人骨髓单个核细胞的分离，可采用Ficoll-Hypaque（比重1.077 g/ml），或Percoll（比重1.073 g/ml）。后者毒性小，且分离细胞纯度较好。

2、 PBS或基础培养基清洗细胞两次。

★ 注意：两次离心速度不同。第一次收集的细胞悬液中含有Ficoll-Hypaque或Percoll，应加足量PBS稀释，离心速度高。第二次离心时，可用常规速度沉降细胞。

3、 弃上清，用完全培养基重悬细胞。

4、 细胞计数，调整细胞浓度为5-7.5×10⁶ /ml。

5、 根据拟采用培养瓶或皿的底面积，计算接种细胞总量。一般而言，细胞来源不同，接种密度可适当调整， 5-10×10⁵ /cm²适于多数情况下人骨髓间充质干细胞的培养。如细胞来源于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的骨髓或经胶原酶消化的骨髓小粒，接种密度可较低；如细胞来源于化疗后骨髓或老年人，细胞接种密度可达1.0×10⁶ /cm²。

6、 将接种好的细胞于条件为温度37 °C、CO₂浓度5%、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。根据细胞生长状况换液。

★ 注意：一般文献推荐培养48小时后去除非贴壁细胞。然而，根据我们的专利技术，骨髓单个核细胞培养48小时后，将贴壁细胞与非贴壁细胞分别培养，两种体系都收获的骨髓MSC数量相近。因此，我们强烈推荐：单个核细胞接种次日观察有无污染；如无污染现象，可持续培养5-7天，或至培养基变黄。之后，去除非贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基继续培养，常可获得更多的间充质干细胞。

三、人脐带间充质干细胞培养

1. 按照常规方法分离人脐带Walton胶中的细胞。

★ 注意：从脐带组织中分离细胞的方法，严重影响最终所得细胞纯度和质量。脐带组织中含有内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、外膜细胞、间充质干细胞乃至单核巨噬细胞等。以上细胞均可贴壁，有些生长速度也较快，且细胞也多呈纺锤形。更有趣的是，部分细胞也表达CD29，CD44，CD73等表面标记。这些细胞不易与间充质干细胞区分。建议使用酶消化法进行脐带间充质干细胞的分离，以保障所得细胞纯度。

2. PBS清洗细胞1次。

3. 弃上清，用完全培养基重悬细胞。

4. 细胞计数，调整细胞浓度为5×10⁶ /ml。

5. 根据拟采用培养瓶或皿的底面积，计算接种细胞总量。一般而言，一根正常的脐带，经消化后可接种于2-4个直径为150 mm的培养皿。

6. 将接种好的细胞置于5% CO₂和饱和湿度的37 °C培养箱培养。根据细胞生长状况换液。

★ 注意：一般文献推荐培养48小时后去除非贴壁细胞。我们建议：培养次日观察有无污染；如无污染现象，可持续培养5-7天，或至培养基颜色变黄。之后，去除非贴壁细胞，加入新鲜的完全培养基继续培养。

四、脂肪间充质干细胞的分离

1. 人脂肪组织来自脂肪抽吸患者的废弃脂肪组织。

2. 无菌PBS反复漂洗除菌。

3. 将脂肪组织转移至50 ml或250 ml离心管，加入等体积的使用alpha-MEM配制的胶原酶I溶液，使其终浓度达到0.1%（重量/体积）。

4. 37 °C，摇床（120rpm）消化2小时以上。

5. 室温静置10 min，吸除上层油滴。

6. 离心，800 g，10 min，收集消化细胞。

7. PBS洗涤一次，500 g，10 min。MSC无血清完全培养基悬浮细胞。

8.计细胞数，调整细胞浓度，按照5.0×10⁵-1.0×10⁶ /cm²底面积接种。

9.次日观察，如无污染，继续培养至培养基颜色变黄，或贴壁细胞密度达到30%以上。补充新鲜的MSC无血清完全培养基。

10. 细胞密度达到80%左右时，按照以下步骤传代培养。

五、间充质干细胞的换液

吸去旧的间充质干细胞的完全培养液，加入足量新鲜的预热至37 °C的间充质干细胞完全培养液。

换液时间：当间充质干细胞的完全培养液变酸（培养液的颜色变黄），而且此时细胞尚未达到80%融合，则应该予以换液。一般来说，间质干细胞的换液间隔为3-4天。

六、间充质干细胞的传代

间充质干细胞生长至80％融合时，就应该按照下面步骤进行传代。

★注意：为维持间充质干细胞的多向分化能力和增殖能力，强烈建议细胞达80%时即进行传代培养。如细胞密度过大，细胞会出现自发分化现象，表现为细胞大小不一，I型胶原等胞外基质分泌量明显增加，导致使用胰蛋白酶消化时，细胞成片脱落，最终收获的细胞数反而下降。因此，不可让间充质干细胞完全融合或过度融合，这将严重影响细胞传代后的生长状态。

1. 吸去培养液。

2. 用1×PBS洗涤细胞2次，以去除残留的培养液。

★注意：使用无血清体系培养的间充质干细胞，其贴壁能力远不及血清培养细胞。因此，如用培养皿培养，建议沿培养皿的侧壁缓缓加入PBS；如用培养瓶培养，建议沿培养瓶的上壁加入PBS，以免细胞脱落，影响收获细胞数。

3. 加入PBS，之后加入0.25％ Trypsin-0.02% EDTA，PBS与胰蛋白酶体积比为4:1，两者总量以覆盖培养皿或培养瓶表面为宜。轻轻旋转，置37 °C培养箱中消化3－5分钟。用手轻拍培养器皿的侧壁，显微镜下可见绝大部分细胞变圆，极少量细胞贴壁仍呈纺锤形，极少量细胞已经悬浮即可终止消化。依据不同批次胰蛋白酶活性不同，消化的时间以显微镜下观察细胞变圆为准，但是，推荐消化时间不低于3分钟。

★注意：对于人间充质干细胞，尤其是利用该体系培养的细胞而言，其消化脱壁的时间应该较短，难以消化脱壁的细胞多数可能不是间充质干细胞，而是其他的杂细胞。在原代培养第一次传代时，尤其注意消化时间；如将所有细胞收获，其中必然含有单核巨噬细胞等杂细胞。

4. 立即加入等体积的间充质干细胞完全培养液，用吸管吸取液体，反复吹打培养器皿底壁，使细胞彻底脱离瓶/皿底壁。

★注意：吹打时动作不宜太猛，不要产生气泡。对于一个细胞而言，气泡的张力很大，气泡的破裂足以杀死周围的细胞，使细胞内基因组DNA释放，细胞呈粘稠的团状物，严重影响了收获数量和质量。

5. 离心（250 g，5 min），吸去上清液。

6. 用2－3 ml间充质干细胞的完全培养液重悬细胞。

7. 按照6000个细胞/cm²的密度来接种细胞。

★注意：一般而言，早期代次（1-3代）MSC按照1:3-5传代，5代以后的细胞以1:2传代较好。

8. 加足够的间充质干细胞的完全培养液，在37 °C，5％CO₂和饱和湿度的培养箱中培养。

七、 间充质干细胞冻存

1. 细胞消化和计数，用胰酶对待冻存的细胞进行消化，并对细胞进行计数。

2. 500 g，离心5-8 min，去掉上清。

3. 根据细胞计数的情况，加入适量的冻存液，使细胞密度在1×10⁶/ml左右（或根据自己希望达到的细胞密度）。

4. 轻轻地重悬细胞（务必重悬均匀），将重悬的细胞按等份加入到灭菌的冻存管（需提前做好标记或者贴上标签）中，旋紧冻存管盖。

5. 将冻存管放入程序降温冻存盒中，然后将冻存盒直接放入-80 °C。

6. 第二天将细胞从-80 °C转移到液氮中。

八、间充质干细胞复苏

1.配制人间充质干细胞无血清完全培养基，放入37 °C水浴中预热，离心管中加入预热的适量培养基；

2.从液氮中取出间充质干细胞迅速放入37 °C水浴快速解冻；

3.将复苏细胞滴加入预热的完全培养基中，500 g离心5-8 min；

4.弃上清，加入适量完全培养基，将培养瓶置于37 °C，5% CO2、饱和湿度的无菌恒温培养箱中培养。